hanraoldman SOJUBOX

ISCUSSION
The pathogenicity of rIHNV GFP and rIHNV-Gvhsv GFP recombinant viruses was assessed by determining cumulative mortalities, clinical external signs and histopathology induced by experimental infection of juvenile rainbow trout. Fish infected with wild type viruses (IHNV or VHSV) showed external signs (dark coloration, distended visceral cavity, exophthalmia and petechial haemorrhages at the base of the fins and abdomen) (Bootland & Leong 1999, Smail 1999) and histopathological changes (Amend et al. 1969, Yasutake & Amend 1972, Wolf 1988) typical of IHN and VHS. The mortality rates in fish groups infected with recombinant viruses were similar to the negative uninfected controls and the few dead fish did not show external clinical signs or histopathological changes. The lack of mortalities and histopathological changes in rIHNV-Gvhsv GFP infected fish had been previously described in the zebrafish by Novoa et al. (2006). We have previously shown that modifications induced in the viral G protein gene can modify mortality kinetics and viral pathogenesis (Romero et al. 2005). Kim et al. (1994), analyzed a G-mutant strain, RB-1, that was particularly attenuated and its tissue distribution was markedly different. Although the NV gene is not necessary for completing the viral cycle (Biacchesi et al. 2000a,b) its exchange for the GFP gene could modify some viral characteristics. In our experiments, cell cultures infected with rIHNV GFP or rIHNV-Gvhsv GFP showed green fluorescence in the cytoplasm, but only those treated with rIHNV-Gvhsv GFP developed a clear cytopathic effect. Results obtained using cell cultures experimentally infected with rIHNV GFP are in agreement with previous results obtained by Biacchesi et al. (2000a) who detected low levels of GFP expression in rIHNV GFP infected cells by UV-light microscopy. However, these authors did not describe the appearance of CPE and morphological changes in the cell line. Further investigation is required to determine the cause of the observed difference in the replication capacity of the 2 recombinant viruses. IHNV route of entry and progression has been studied in depth (Yamamoto 1990, Yamamoto & Clermont 1990, Drolet et al. 1994) and it has been demonstrated that IHNV infection progresses from the gills to the circulatory system and from the oral region into the gastrointestinal tract and circulatory system. By inoculation (ip) of different virulent recombinant IHN viruses (rIHNV and rIHNV-Gvhvs) Romero et al. (2005) detected virus in the liver, kidney and gills as early as 3 d p.i.. In the present study, rIHNV GFP and rIHNV-Gvhsv GFP were not detected in infected fish in the kidney or liver by RT-PCR. This result suggests that tissue tropism or levels of infection might be affected by the introduced changes in the recombinant viruses described here. It is not evident if the introduction of the GFP gene or the substitution of the NV gene were responsible for the changes observed in virulence and pathogenicity. It is important to point out that NV gene elimination was shown not to be required for pathogenesis of a novirhabdovirus (Alonso et al. 2004). High levels of protection were conferred by vaccination with the GFP recombinant viruses against IHNV and VHSV. The heterologous protection has been previously described in vaccination trials against IHNV using different vaccination approaches. Engelking & Leong (1989a,b), using purified RB-1 IHNV strain glycoprotein, recorded cross-protective immunity against 5 types of IHNV. DNA vaccines encoding the viral G protein of different rhabdoviruses (IHNV, VHSV, SHRV and SVCV) elicited protective immunity against IHNV and VHSV (Kim et al. 2000, Lorenzen et al. 2002). The results obtained here with rIHNV GFP and rIHNV-Gvhvs GFP in the vaccination trials also demonstrate heterologous protection against both IHNV and VHSV. The timing (30 d post-vaccination) of the induced protection with the recombinant viruses is interesting. IHNV vaccines based on DNA plasmids elicited high protection levels against this rhabdovirus but protection was transient, and often did not persist past 30 d post-vaccination (LaPatra et al. 2001). It might be that the recombinant viruses provide prolonged heterologous protection because they replicate after vaccination (although not by much, as shown by the data presented in this paper), while the DNA vaccines do not. Antibody production is one of the mechanisms involved in the effectiveness of a vaccine. LaPatra et al. (1993) and Lorenzen & LaPatra (1999) showed that rainbow trout can produce specific and highly functional antibodies that are able to neutralise IHNV in vitro as well as in vivo. The kinetics of antibody production following an experimental infection with the recombinant viruses were not similar to those previously described for IHNV. The rIHNV GFP was able to induce specific IHNV antibodies but the titer did not increase with time. As expected, the rIHNV-Gvhsv GFP was able to stimulate VHSV antibody production but the titer did not increase with time. The highest antibody titer was recorded at Week 10. As shown in the results, the recombinant viruses did not induce high antibody production that could explain the level of protection obtained. It is likely that other immune mechanism(s) are involved in the observed protection. A correlation between high antibody production, high levels of antiviral cytokine expression and protection has been described using several fish vaccination models (Boudinot et al. 1998, McLauchlan et al. 2003). Kim et al. (2000) using a DNA vaccine encoding the viral glycoprotein, correlated an early, non-specific antiviral protection with high levels of Mx protein in the kidney and liver, and they proposed that the initial IFNαβ induction was the basis of the protection. The critical role for a type I interferon-like response in early anti-viral defence against IHNV has been confirmed by using quantitative real-time reverse transcriptase PCR methodology (Purcell et al. 2004, Acosta et al. 2005, Overturf & LaPatra 2006). The treatment with the GFP recombinant viruses used here, did not induce significant antiviral gene expression in the kidney or in the liver and the levels recorded were always as low as the levels obtained in the control group. Similar expression profiles were obtained by Novoa et al. (2006) for rIHNV-Gvhvs GFP infected zebrafish. Our results support the hypothesis that the IFNαβ pathway is not implicated in the cross-protection observed 30 d after vaccination with the GFP recombinant viruses (rIHNV GFP and rIHNV-Gvhsv GFP) and that other immune mechanism(s) are likely to be involved. Recent studies have shown that apoptosis may play an important role in many viral infections (Thoulouze et al. 1997, Gadaleta et al. 2002, Blaho 2003, 2004). Cell death due to rhabdovirus infection is thought to result from necrosis following cell membrane damage caused by the budding virions (Wolf 1988). In addition, apoptosis appears to be involved in cell death caused by rhabdovirus infection in cell lines (Björklund et al. 1997, Chiou et al. 2000, Du et al. 2004) and in tissues (Eléouët et al. 2001). Recent studies have indicated that highly virulent viruses may use one or more strategies to inhibit apoptosis, including inhibition of transcription factors and caspase activation to complete their viral cycle before programmed cell death (Fazakerley & Allsopp 2001, Liacarta & Harty 2003). Morimoto et al. (1999) compared the pathogenicity, and the ability to induce apoptosis, of 2 variants of rabies virus in primary neuron cultures. It was shown that the less pathogenic variant had a high level of G protein expression and induced significantly more apoptosis in infected cells than the more pathogenic variant. The down-regulation of G protein expression in neuronal cells contributed to rabies virus pathogenesis by preventing apoptosis. Our results would support this phenomenon. rIHNV-Gvhsv GFP induced higher apoptosis levels than the IHNV wild type. It is possible that the protection conferred by rIHNV-Gvhsv GFP against IHNV and VHSV could be related to an increase in apoptosis which reduces spread of the virus. The modifications in the recombinant viruses explains their limited capacity to replicate in fish tissues. Our results indicate that reverse genetics is a powerful tool for the generation of modified viruses that could be used as vaccines. Based on the results obtained in challenge experiments, the recombinant virus rIHNV-Gvhsv GFP represents a promising live vaccine against fish rhabdoviruses. On the other hand, the low antibody titer and antiviral cytokine expression cannot explain the high level of protection obtained following experimental challenge. Further research is needed to clarify the mechanisms involved which may include not only immune responses but also other cellular responses such as apoptosis.


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면담
rIHNV GFP와 rIHNV-Gvhsv GFP 재조합형 바이러스의 병원성은 젊은 무지개 송어의 실험적인 감염에 의해 유도된 점증적으로 사망, 임상 외부 표시 및 histopathology를 결정해서 사정되었다. 사나운 유형 바이러스로 감염된 물고기는 (IHNV 또는 VHSV) 외부 표시를 (탄미익의 기초에 내장 구멍이 어두운 채색에 의하여, exophthalmia petechial 출혈 복부 부풀고) (Bootland & Leong 1999년, Smail 1999년) 보여주었다와 IHN와 VHS의 전형 조직병리학적인 변화 (1969년, Yasutake를 그 외 여러분 수정하고십시오 & 1972년 의 늑대 1988년을 수정하십시오). 재조합형 바이러스로 감염된 물고기 그룹에 있는 사망율은 부정적인 uninfected 통제와 유사하 몇몇 죽은 물고기는 외부 임상 표시 또는 조직병리학적인 변화를 보여주지 않았다. rIHNV-Gvhsv GFP에 의하여 감염된 물고기에 있는 사망 그리고 조직병리학적인 변화의 부족은 Novoa에 의해 zebrafish에서 이전에 그 외 여러분 기술되었었다 (2006년). 우리는 이전에 바이러스성 G 단백질 유전자에서 유도된 수정이 사망 활동과 바이러스성 병인 (Romero 그 외 여러분 2005년)를 변경할 다는 것을 보여주었다. 김은 그 외 여러분 (1994년), G 돌연변이체 긴장이라고, 분석해 특히 그것의 조직 배급 약하게 한 RB-1, 표시되어 있 달랐다. NV 유전자가 바이러스성 주기 (Biacchesi 그 외 여러분 2000a 완료에 필요하지 않더라도, b) GFP 유전자를 위한 그것의 교환은 몇몇 바이러스성 특성을 변경할 수 있었다. 우리의 실험에서는, rIHNV GFP로 감염된 세포 배양 또는 rIHNV-Gvhsv GFP는 세포질에 있는 녹색 형광을 보여주었다, 그러나 rIHNV-Gvhsv GFP로 대우된 그들은 명확한 cytopathic 효력을 개발했다. 실험적으로 rIHNV GFP로 감염된 세포 배양을%s 얻어진 결과는 Biacchesi가 그 외 여러분 얻어진 이전 결과와 일치하여 rIHNV GFP에 의하여 감염된 세포에 있는 GFP 표정의 저급을 누구가 UV 빛 현미경 검사법에 의하여 검출한지 이다 (2000a). 그러나, 이 저자는 CPE의 외관을 기술하지 않으며 세포에 있는 형태학상 변화는 일렬로 세운다. 더 상세한 조사는 2마리의 재조합형 바이러스의 복제 수용량에 있는 관찰된 다름의 원인을 결정할 것을 요구된다. 입장과 진행성의 IHNV 노선은 공부한 충분히 (Yamamoto 계속 1990년, Yamamoto이다 & Clermont 1990년, Drolet 그 외 여러분 1994년)와 IHNV 감염이 위장 지역 및 순환 체계로 아가미 순환 체계에와 구강 영역에서 점진한ㄴ다는 것을 설명되었다. 다른 악성 (ip) 재조합형 IHN 바이러스 (rIHNV와 rIHNV-Gvhvs) Romero의 접종에 의하여 그 외 여러분 (2005년) 3 d p.i. 이미 간, 신장 및 아가미에 있는 바이러스를 검출했다. 존재하는 학문에서는, rIHNV GFP와 rIHNV-Gvhsv GFP는 RT-PCR에 의해 신장 간에 있는 감염된 물고기에서 검출되지 않았다. 이 결과는 감염의 조직 굴곡 운동 또는 수준이 여기에서 기술된 재조합형 바이러스에 있는 소개한 변화에 의해 영향을 받을지도 모르다는 것을 건의한다. 그것은 GFP 유전자의 소개 또는 NV 유전자의 대용암호가 관찰된 독성과 병원성에서 변화에 책임 경우에 있으면 분명하지 않다. NV 유전자 제거가 novirhabdovirus (Alonso 그 외 여러분 2004년)의 병인을%s 요구되지 않기 위하여 보였다는 것을 지적하는 것이 중요하다. 보호의 상부는 IHNV와 VHSV에 대하여 GFP 재조합형 바이러스를 가진 백신 주사에 의해 수여되었다. 이종 보호는 다른 백신 주사 접근을%s IHNV에 대하여 백신 주사 예심에서 이전에 기술되었다. Engelking & Leong (1989a 의 b), 순화된 RB-1 IHNV 긴장 당단백을%s, IHNV의 5가지의 유형에 대하여 기록된 십자가 방어적인 면제. 다른 rhabdoviruses (IHNV, VHSV, SHRV 및 SVCV)의 바이러스성 G 단백질을 암호로 고쳐 써 DNA 면역주사는 IHNV와 VHSV (김 그 외 여러분 2000년, Lorenzen 그 외 여러분 2002년)에 대하여 방어적인 면제를 이끌어냈다. 백신 주사 예심에 있는 rIHNV GFP 그리고 rIHNV-Gvhvs GFP로 여기에서 얻어진 결과는 또한 IHNV와 VHSV 둘 다에 대하여 이종 보호를 설명한다. 재조합형 바이러스를 가진 유도한 보호의 타이밍 (30의 d 포스트 백신 주사)는 재미있다. DNA 플라스미드에 근거를 둔 IHNV 면역주사는 이 rhabdovirus에 대하여 높은 보호 수준을 이끌어냈다 그러나 보호는 일시적이고, 30의 d 포스트 백신 주사 (LaPatra 그 외 여러분 2001년) 지나서 수시로 지속하지 않았다. DNA 면역주사는 그러나 백신 주사 후에 (이 서류에서 선물되는 자료에 의해 보이는 다량에 의하여 아닙니다,) 복제하기 때문에 재조합형 바이러스가 머리말을 붙인 이종 보호해준다 일지도 모르다. 항체 생산은 면역주사의 효과에서 포함된 기계장치의 한개이다. 무지개 송어가 생체 조건 뿐 아니라 IHNV를 생체외에서 중화할 수 있는 높게 기능적인 항체와 특성를 생성할 다는 것을 LaPatra 그 외 여러분 (1993년) 및 Lorenzen & LaPatra (1999년)는 보여주었다. 재조합형 바이러스로 실험적인 감염을 따르는 항체 생산의 활동은 이전에 IHNV를 위해 기술된 그들과 유사하지 않았다. rIHNV GFP는 특정한 IHNV 항체를 유도할 수 있었다 그러나 역가는 시간으로 증가하지 않았다. 예상했던대로, rIHNV-Gvhsv GFP는 VHSV 항체 생산을 자극할 수 있었다 그러나 역가는 시간으로 증가하지 않았다. 가장 높은 항체 역가는 결과에서 보이는 것처럼 주 10.에, 재조합형 바이러스 유도하지 않았다 얻어진 보호의 수준을 설명할 수 있던 높은 항체 생산을 기록되었다. 다른 면역성이 있는 기계장치가 관찰된 보호에서 포함된다 확률이 높다. 높은 항체 생산, 항바이러스 cytokine 표정의 상부 및 보호 사이 상호 관계는 몇몇 물고기 백신 주사 모형 (Boudinot 그 외 여러분 1998년, McLauchlan 그 외 여러분 2003년)를 사용하여 기술되었다. 신장 및 간에 있는 Mx 단백질의 상부와, 일반적인 항바이러스 보호 상관된 바이러스성 당단백을 일렀던 것 암호로 고쳐 써 DNA 면역주사를 사용하여 김은 그 외 여러분 (2000년), 및 그들 머리글자 IFNαβ 감응작용이 보호의 기초이었다는 것을 제시했다. IHNV에 대하여 이른 항바이러스 방위에 있는 응답 인터페론 같이 유형 I를 위한 긴요한 역할은 양이 많은 순간 반전 transcriptase PCR 방법론 (Purcell 그 외 여러분 2004년, Acosta 그 외 여러분 2005년, Overturf & LaPatra 2006년)를 사용해서 확인되었다. 여기에서 이용된 GFP 재조합형 바이러스를 가진 처리는, 신장에 있는 뜻깊은 항바이러스 유전자 발현을 유도하지 않았다 또는 기록된 간 및 수준에서 항상 낮았다 통제반에서 얻어진 수준은. 유사한 표정 단면도는 rIHNV-Gvhvs GFP에 의하여 감염된 zebrafish를 위한 Novoa에 의해 (2006년) 그 외 여러분 얻어졌다. 우리의 결과는, 그리고 다른 면역성이 있는 기계장치가 확률이 높다 포함되기 위하여 IFNαβ 통로가 GFP 재조합형 바이러스 (rIHNV GFP와 rIHNV-Gvhsv GFP)를 가진 백신 주사 후에 십자가 보호에서 관찰했다 30 d를 내포되지 않는다 가설을 지원한다. 최근 학문은 apoptosis가 많은 바이러스성 감염 (Thoulouze 그 외 여러분 1997년, Gadaleta 그 외 여러분 2002년, Blaho 2003년, 2004년)에 있는 중요한 역할을 할지도 모른다 보여주었다. rhabdovirus 감염 때문에 세포 죽음은 괴사 싹트는 virions (늑대 1988년)에 의해 초래된 따르는 세포막 손상에서 유래하고 생각된다. 더하여, apoptosis는 세포 선 (Björklund 그 외 여러분 1997년, Chiou 그 외 여러분 2000년, Du 그 외 여러분 2004년)와 조직 (Eléouët 그 외 여러분 2001년)에서 rhabdovirus 감염에 기인한 세포 죽음에서 포함되는 것처럼 보인다. 최근 학문은 녹음방송 요인의 금지를 포함하여 apoptosis를 금하기 위하여 높게 악성 바이러스가 한개 이상 전략을 이용할지도 모른다 프로그램한 세포 죽음의 앞에 그들의 바이러스성 주기를 완료하기 위하여, 와 caspase 활성화 나타내었다 (Fazakerley & Allsopp 2001년, Liacarta & Harty 2003년). Morimoto는 그 외 여러분 (1999년) 1 차적인 신경 문화에 있는 광견병 바이러스의 2개의 이체의 apoptosis를, 유도하는 병원성 및 기능을 비교했다. 보다 적게 병원성 이체에는 G 단백질 표정의 고도가 있었다는 것을 보이고 병원성 이체 보다는 감염한 세포에 있는 상당히 더 많은 apoptosis이라고 유도되었다. 신경원 세포에 있는 G 단백질 표정의 아래로 규칙은 광견병 바이러스 병인에 apoptosis를 막아서 공헌했다. 우리의 결과는 이 현상을 지원할 것입니다. rIHNV-Gvhsv GFP는 IHNV 사나운 유형 보다는 더 높은 apoptosis 수준을 유도했다. 보호가 IHNV에 대하여 rIHNV-Gvhsv GFP에 의하여 수여하고 VHSV가 바이러스의 퍼짐을 감소시키는 apoptosis에 있는 증가와 관련있을 수 있었다는 것을 가능하다. 재조합형 바이러스에 있는 수정은 물고기 조직에서 복제하는 그들의 한정된 수용량을 설명한다. 우리의 결과는 반전 유전학이 면역주사로 이용될 수 있던 변경한 바이러스의 발생을%s 강력한 공구다는 것을 나타낸다. 도전 실험에서 얻어진 결과에 기초를 두어, 재조합형 바이러스 rIHNV-Gvhsv GFP는 물고기 rhabdoviruses에 대하여 유망한 살아있는 면역주사를 대표한다. 다른 손에서, 낮은 항체 역가 및 항바이러스 cytokine 표정은 실험적인 도전 다음 얻어진 보호의 고도를 설명할 수 없다. 더 연구는 필요하다 포함된 뿐만 아니라 면역 반응 또한 apoptosis와 같은 다른 세포질 응답을 포함할지도 모른다 기계장치를 명백하게 하기 위하여.